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Id: biblio-846818
Autor: Cavalher, Felicia Peterson.
Título: Caracterização funcional das isoformas de splicing do gene ADAM23 / Functional characterization of ADAM23 gene splicing isoforms.
Fonte: São Paulo; s.n; 2012. 196 p. graf, tab, ilus.
Idioma: pt.
Tese: Apresentada a Universidade de São Paulo. Instituto de Química para obtenção do grau de Doutor.
Resumo: A ADAM23 é uma glicoproteína transmembrana pertencente à família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) que apresenta a estrutura protéica típica dos membros desta família, mas não possui atividade de metaloprotease. O gene ADAM23 apresenta três isoformas de splicing, α, ß e γ, que codificam proteínas com porções C-terminais distintas. As isoformas α e ß codificam proteínas com domínios transmembranas diferentes, enquanto γ provavelmente consiste em uma isoforma secretada ou citoplasmática de ADAM23. Foi demonstrado que o gene ADAM23 está epigeneticamente silenciado em tumores de mama de estágios mais avançados e que seu silenciamento está associado a um maior risco de desenvolvimento de metástases e a um pior prognóstico. Recentemente, foi descrito que a proteína ADAM23 interage diretamente com a integrina αVß3 na linhagem tumoral de mama MDA-MB-435, sendo capaz de modular seu estado conformacional, controlando sua ativação. Utilizando RNAi, observou-se que o silenciamento completo do gene ADAM23 (i.e., as três isoformas) aumenta os níveis de αVß3 em conformação ativa na superfície das células MDA-MB-435, promovendo um incremento de sua capacidade migratória e adesiva. No presente trabalho, avaliamos por reações de amplificação em tempo real o perfil de expressão das três isoformas de splicing do gene ADAM23 em cinco tecidos normais (mama, cólon, cérebro, próstata e pâncreas) e em doze linhagens tumorais derivadas destes tecidos. Observamos diferenças nos níveis de expressão das isoformas em todas as amostras avaliadas, tanto dentro de uma determinada amostra, como quando comparamos tecidos normais entre si ou com linhagens tumorais. A isoforma γ é a mais expressa em todos os tecidos normais (exceto em cérebro) e em todas as linhagens tumorais. Em tecido normal de mama e de próstata e nas doze linhagens tumorais, ADAM23α é a segunda isoforma mais expressa, sendo ß a menos expressa. Constatamos também que a fração representada por cada isoforma, em relação à expressão total do gene ADAM23, está alterada nas linhagens tumorais, em comparação aos tecidos normais correspondentes. Com o intuito de elucidar a função das isoformas de ADAM23 separadamente, utilizamos shRNAs (short hairpin RNAs) para reduzir a expressão de cada isoforma de modo individual e específico na linhagem tumoral MDA-MB-435, e avaliamos seu efeito na proliferação, na morfologia, na adesão e no espraiamento celular. Verificamos que a redução da expressão da isoforma γ aumentou significativamente a taxa de proliferação das células MDA-MB-435 cultivadas em modelo tridimensional. Demonstramos também que ADAM23γ participa da regulação da morfologia e da capacidade de espraiamento das células MDA-MB-435 em condições padrão de cultivo (i.e., meio de cultura completo e placas não-sensibilizadas com substratos) e em componentes específicos da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno I e matrigel. A isoforma α também está envolvida no controle da morfologia e do espraiamento da linhagem MDA-MB-435, porém, de modo distinto da isoforma γ. Já ADAM23ß não interfere na morfologia das células MDA-MB-435 e tem efeito marginal no espraiamento celular apenas em condições padrão de cultivo. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as isoformas de ADAM23 são diferencialmente expressas em tecidos normais e tumorais, e exercem funções biológicas distintas

ADAM23 is a transmembrane glycoprotein that belongs to the ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family of proteins and exhibits the typical protein structure of the family members, but it doesn't have metalloprotease activity. The ADAM23 gene has three splicing isoforms, α, ß and γ, that code for proteins with different C-terminal regions. Isoforms α and ß code for proteins with different transmembrane domains, while γ probably constitute a secreted or cytoplasmatic isoform of ADAM23. It has been demonstrated that the ADAM23 gene is epigenetically silenced in advanced stage breast tumors and that its silencing is associated with a higher risk of developing metastases and with a worse prognosis. Recently, it was described that ADAM23 protein interacts directly with αVß3 integrin in the breast tumor cell line MDA-MB-435, modulating its conformational state and controlling its activation. Using RNAi, it was observed that the complete silencing of ADAM23 gene (the three isoforms) raises the levels of αVß3 in its active conformation in the surface of MDA-MB-435 cells, promoting an increase in its migratory and adhesive capacity. In the present work, we evaluated by real time PCR the expression pattern of the three splicing isoforms of ADAM23 gene in five normal tissues (breast, colon, brain, prostate and pancreas) and in twelve tumor cell lines derived from these tissues. We observed differences in the expression levels of the three isoforms in all samples, either within a specific sample or comparing normal tissues among them or with tumor cell lines. Isoform γ has the highest expression in all normal tissues (except for brain) and in all tumor cell lines evaluated. In breast and prostate normal tissues and in all tumor cell lines, ADAM23α is the second most expressed isoform, while ß is the less expressed. We also noticed that the ratio represented by each isoform, relative to the total expression of ADAM23 gene, is altered in the tumor cell lines, compared to the corresponding normal tissues. With the aim to elucidate the function of ADAM23 isoforms separately, we used shRNAs (short hairpin RNAs) to reduce the expression of each isoform specifically in the MDA-MB-435 tumor cell line, and studied its effects in proliferation, morphology, adhesion and cell spreading. We observed that the reduced expression of isoform γ significantly increased the proliferation rate of MDA-MB-435 cells cultivated in tridimensional system. Also, we demonstrated that ADAM23γ participates in the regulation of cell morphology and spreading of MDA-MB-435 cells, both in standard culture conditions (cell culture media with fetal serum and in plates not sensitized with substrates) and in specific components of extracellular matrix, such as fibronectin, collagen type I and matrigel. Isoform α is also involved in the control of morphology and spreading of MDA-MB-435 cell line, although in a distinct manner from isoform γ. ADAM23ß doesn't interfere in the morphology of MDA-MB-435 cells and plays a discrete role in cell spreading only under standard culture conditions. Together, our results demonstrate that ADAM23 isoforms are differently expressed in normal and tumoral tissue, and play distinct biological roles
Descritores: Proteínas ADAM/classificação
Metaloproteases
Isoformas de Proteínas/genética
-Neoplasias da Mama
Biologia Celular
Proliferação Celular/genética
Expressão Gênica/genética
Glicoproteínas de Membrana
Processamento de Proteína/genética
Tipo de Publ: Estudos de Avaliação
Responsável: BR40.1 - DBD - Divisão de Biblioteca e Documentacão do Conjunto das Químicas
BR40.1; T 574.88, C376c. 30100019922


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Id: lil-605668
Autor: Azevedo, Adriana de Souza.
Título: Desenvolvimento de vacinas de DNA contra o vírus da dengue baseadas na proteína do envelope viral / Development of DNA vaccines against dengue virus based on viral envelope protein.
Fonte: Rio de Janeiro; s.n; 2011. xix, 183 p. ilus, tab, mapas, graf.
Idioma: pt.
Tese: Apresentada a Instituto Oswaldo Cruz para obtenção do grau de Doutor.
Resumo: A dengue é uma doença causada pelo vírus da dengue (DENV1- 4). Apesar dos vários estudos, ainda não existe uma vacina comercialmente disponível. A proteína do envelope (E) de DENV apresenta-se como o maior componente protéico da superfície viral. Conseqüentemente, esta proteína é o principal alvo para a indução de uma resposta imune protetora, provavelmente baseada em anticorpos neutralizantes. No presente trabalho, nós avaliamos o potencial protetor de vacinas de DNA baseadas na proteína E de DENV2. para isto, foram construídos dois pasmídeos, pE1D2 e pE2D2, que contêm as seqüências que codificam o eCtodomínio da proteína E (domínios I, II e III) ou somente o seu domínio III, respectivamente, clonadas da montante à seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA). Os dois plasmídeos mediaram à expressão e secreção das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas, detectadas com anticorpos anti-DENV2 e avaliadas por ensaios de imunofluorescência ou marcação metabólica seguida de imunoprecipitação. Ambas as vacinas de DNA foram capazes de induzir respostas imunes com produção de anticorpos neutralizantes em camundongos Balb/c, com títulos mais elevados nos animais imunizados com o pE1D2. A vacina Pe1D2 também se mostrou mais protetora nos testes de desafio com uma dose letal de DENV2, induzindo 100 porcento de sobrevivência nos camundongos imunizados, enquanto que 45 porcento dos animais vacinados com o plasmídeo Pe2D2 morreram após a infecção. Além disso, 10 porcento e 65 porcentodos camundongos imunizados com pE1D2 e pE2D2, respectivamente, apresentaram morbidade frente ao desafio letal. As vacinas pE1D2 e pE2D2 também foram testadas combinadas com o vírus quimérico YF17D-D2, em um sistema de dose e reforço ou em imunizações simultâneas. O vírus quimérico YF17D menos D2 foi construído com a substituição dos genes prM e E do vírus vacinal da febre amarela 17DD pelos genes prM e E de DENV2. a vacina de DNA pE1D2 combinada com a quimera YF17D menos D2 induziu altos níveis de anticorpos neutralizantes nos animais vacinados com os diferentes esquemas de imunização. Além disso, esses animais apresentaram 100 porcento de sobrevivência frente ao desafio letal com DENV2, com ausência de qualquer sinal clinico da infecção. O efeito sinérgico da imunização combinada também foi evidenciado quando combinamos a vacina pE2D2 e YF17D menos D2, que gerou 100 porcento de sobrevivência nos animais desafiados. A resposta imune celular foi avaliada pela produção de IFN- por células TCD8 mais em ensaios de ELISPOT, evidenciando a ativação destas células nos animais imunizados com as pE1D2 independente da sua combinação com a quimera YF17D menos D2. Além disso, a análise do perfil fenotípico das células TCD4 a mais e TCD8 mais mostrou um percentual menor de linfócitos CD62L mais nos animais vacinados com o pE1D2 isolado ou combinado com o vírus quimérico, indicando que a vacina de DNA pode influenciar nos processos de ativação das células T. Posteriormente, foram construídas novas vacinas de DNA que codificam os ectodomínios da proteína E de DENV1, 3 e 4 (pE1D1, pE1D3 e pE1D4), cuja expressão foi confirmada in vitro, e que serão testadas futuramente em modelos animais.
Descritores: Dengue
DNA
Imunização
Processamento de Proteína
Vacinas
Limites: Seres Humanos
Tipo de Publ: Livros de Texto
Responsável: BR15.1 - Biblioteca de Ciências Biomédicas


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Texto completo SciELO Brasil
Arns, C. W
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Id: lil-595568
Autor: Silva, L. H. A; Cardoso, K. C; Silva, M. J; Spilki, F. R; Arns, C. W.
Título: Clonagem das glicoproteínas transmembrana G e F de um isolado brasileiro do vírus respiratório sincicial bovino em sistema procarioto / Cloning of the transmembrane glycoproteins G and F from a Brazilian isolate of bovine respiratory syncytial virus in a prokaryotic system
Fonte: Arq. bras. med. vet. zootec;63(3):552-558, June 2011. ilus.
Idioma: en.
Projeto: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
Resumo: The aim of this work was the cloning of those transmembrane glycoproteins G and F from an isolate bovine respiratory syncytial viruses (BRSV) - a Brazilian isolate of BRSV, named BRSV-25-BR in previous studies, in a prokaryotic system to proceed the sequencing of larger genomic fragments. The nucleotide substitutions were confirmed and these clones may also be used in further studies regarding the biological effects of those proteins in vitro and in vivo.

O objetivo deste trabalho foi a clonagem das glicoproteínas transmembrana G e F de um isolado de vírus respiratório sincicial bovino (BRSV) - um isolado brasileiro denominado BRSV-25-BR- que já demonstrou possuir mutações em regiões altamente conservadas do gene da proteína G - em sistema procariótico, com o intuito de sequenciar fragmentos genômicos maiores. As substituições de nucleotídeos foram confirmadas e tais clones podem ser utilizados em futuros estudos sobre os efeitos biológicos destas proteínas tanto in vitro como in vivo.
Descritores: Glicoproteínas
Processamento de Proteína
Vírus Sincicial Respiratório Bovino
Limites: Animais
Bovinos
Responsável: BR68.1 - Biblioteca Virginie Buff D'Ápice


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Id: lil-449131
Autor: Bezerra, W. M; Carvalho, C. P; Moreira, R. de A; Grangeiro, T. B.
Título: Establishment of a heterologous system for the expression of Canavalia brasiliensis lectin: a model for the study of protein splicing
Fonte: Genet. mol. res. (Online);5(1):216-223, Mar. 31, 2006. graf, ilus.
Idioma: en.
Resumo: During its biosynthesis in developing Canavalia brasiliensis seeds, the lectin ConBr undergoes a form of protein splicing in which the order of the N- and C-domains of the protein is reversed. To investigate whether these events can occur in other eukaryotic organisms, an expression system based on Pichia pastoris cells was established. A DNA fragment encoding prepro-ConBr was cloned into the vector pPICZB, and the recombinant plasmid was transformed in P. pastoris strain GS115. Ten clones were screened for effective recombinant protein production. Based on Western blot analysis of the two clones with the highest level of protein expression: 1) diffuse high-molecular mass immunoreactive bands were produced as early as 24 h after induction; 2) a single-, high-molecular mass protein was secreted into the medium, and 3) a significant fraction of the recombinant polypeptides that cross-reacted with anti-ConBr antibodies comprised a band of approximately 34.5 kDa. Diffuse protein bands with high molecular masses are attributed to hyperglycosylation at the single potential N-glycosylation site located in the linker peptide of prepro-ConBr. In contrast, native ConBr is made up of three polypeptides, the intact alpha chain (aa 1-237) and the fragments beta (aa 1-118) and gamma (aa 119-237), which have apparent molecular masses of 30, 16 and 12 kDa, respectively. Apparently, the yeast P. pastoris is not able to carry out all the complex post-translational proteolytic processing necessary for the biosynthesis of ConBr.
Descritores: Canavalia/química
Lectinas de Plantas/genética
Modelos Genéticos
Pichia/metabolismo
Processamento de Proteína/genética
Regulação da Expressão Gênica de Plantas/genética
-Western Blotting
Vetores Genéticos
Lectinas de Plantas/biossíntese
Lectinas de Plantas/química
Reação em Cadeia da Polimerase
Responsável: BR1.1 - BIREME



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